Sezóna 2000/01 Gambrinus ligy byla 8. sezónou v samostatné české lize. Začala 28. července 2000 a skončila 25. května 2001. Titul vyhrál klub AC Sparta Praha, do druhé ligy sestoupily týmy SK České Budějovice a FC Viktoria Plzeň. Nejlepším střelcem ligy se stal s 15 góly Vítězslav Tuma z Drnovic.